血栓性疾病動物模型

正常情況下，機體內的血液在血循環內呈液體狀態，是由于體內存在著相互拮抗的凝血和抗凝血系統。當機體受到某些物理和化學因素的作用，或本身有創傷和感染時，可引起機體免疫和代謝功能發生改變，造成體內凝血和抗凝血系統功能紊亂，終導致血栓形成。血栓形成主要涉及心血管內皮、血流狀態和凝血反應三方面的改變，這三種條件通常合并存在，但常以某一條件為主。此外，當機體血液處于高凝狀態時，如DIC、手術、創傷、妊娠等引起的血液凝固性增高也是血栓形成的原因之一。臨床上血栓性疾病對患者危害，甚至可危及人的生命，所以加強血栓形成機制、血栓臨床診斷、抗血栓藥物方面的研究具有重要意義，這些研究均需要建立理想而實用的血栓動物模型。

1 體外血栓模型

(1)復制方法  取靜脈血，注入體外旋轉圓塑料環內，在體外血栓儀上以17.5r/min轉動10min，然后取下塑料環，將血栓倒在濾紙上吸干水分，測量血栓長度、濕重及干重。

(2)模型特點  模型制作方法操作簡便，可直接觀察血栓形成過程、測定纖維蛋白血栓形成時間和特異血栓形成時間。本模型適用于抗栓抗凝藥物的藥理研究，亦可作藥物溶栓作用的研究。

(3)比較醫學  采用體外旋轉圓環內模擬機體內的血流狀態以形成血栓。當轉環在沿垂直平面上順時針方向旋轉時，可在上下彎月面形成一個既有回流又有二次流的復雜流動區，為血小板聚集及血栓形成提供了有利條件。本模型形成的人工血栓同機體內自然形成的血栓在組織結構上相似。

2 半體內血栓動物模型

(1)復制方法  成年實驗大鼠，按30mg/kg體重的劑量經腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術臺上，頸部皮膚常規消毒與去毛。無菌手術于頸部正中作一切口，鈍性分離出左頸動脈及右頸外靜脈，再取兩根聚乙烯管，分別插入左頸動脈和右頸外靜脈，然后套上另一內有絲線的聚乙烯套管，以便形成大鼠頸動靜脈回路。術畢，立即拔下套管，取出絲線用濾紙吸干殘血，精密稱重。

(2)模型特點  制作方法簡單、經濟，是目前國內常用的血栓動物模型。

(3)比較醫學  當模型大鼠頸動靜脈回路建立后，其血流中的血小板接觸旁路循環中的絲線粗糙面時，可發生黏附、聚集，血小板聚集物環繞絲線表面形成血栓。本方法形成的血栓結構類似于動脈中的白色血栓。用藥物抑制此類血栓形成，除受血流速度和血液黏度因素影響外，主要與藥物抑制血小板黏附和聚集功能有關。

3 體內血栓動物模型

1.物理刺激法

(1)機械性損傷兔血栓模型

①復制方法  體重約為2.5kg的新西蘭兔，按30mg/kg體重的劑量經耳緣靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將兔仰臥固定于手術臺上。用無菌手術分離其一側股深動脈，選擇直徑為1mm的股深動脈血管段，用動脈夾夾住上下兩端，中間留有1.5cm長的血管段為手術部位。在體視顯微鏡下，用7號針頭從血管段上端沿血管向下刺入血管段內，并順勢注入生理鹽水沖凈血管內的血液，然后抽出針頭，再用6號微型刮匙沿刺破孔進入血管，反復搔刮血管內膜。搔刮深度以0.5～0.7cm為宜，搔刮范圍盡可能大些，以刮出少量血管內膜為宜。稍等片刻后，松開遠端動脈夾，使血液充盈血管；待刺孔不滲血時，再取下血管兩端血管夾，觸摸家兔膝內側皮下支動脈搏動示血管通暢后，常規手術逐層縫合，關閉皮膚切口。

②模型特點  術后24h模型動物即開始有血栓形成。模型制作方法簡便，容易操作，重復性好，模型成功率高，但造模過程較費時。采用本方法也可制備靜脈血栓模型。    ③比較醫學  本模型造模機制同人類血栓形成極為相似，當刮匙搔刮損傷動物血管內膜后，可使血管內皮下細胞外基質(ECM)裸露，促使血小板與ECM(主要是膠原纖維)接觸而被激活和黏附；同時裸露的膠原纖維激活因子及損傷的內皮細胞可釋放出組織因子，進一步啟動機體內源性和外源性凝血過程，導致血栓形成。本模型適用于動態觀察血栓形成過程中血栓形態及血栓變化規律以及評價藥物溶栓作用的實驗研究，也適用于與形成和溶解血栓有關的其他實驗研究。

(2)電流刺激誘導大鼠血栓模型

①復制方法  成年實驗大鼠，按30mg/kg體重的劑量經腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將大鼠仰臥固定于手術臺上，頸部皮膚常規消毒與去毛。用無菌手術于頸部正中作一切口，鈍性分離其右側頸總動脈約15mm長；用兩根直徑為1.3mm，間距1.7mm的不銹鋼棒作為刺激電極，將刺激電極和溫度探子鉤于動脈內膜上。采用刺激電流為1.5mA、刺激時間為7min。當血栓阻斷動脈血流后，遠心端動脈溫度驟降，記錄從電刺激開始到溫度驟降所需時間，即為血栓形成時間。

②模型特點  本模型制作方法簡單，容易操作。易受動物年齡、環境溫度的影響，血栓形成時間不均一，實際應用時有局限性。造模過程中需遮蓋手術切口附近的組織，以避免影響血管壁表面溫度和刺激電極與周圍組織接觸。

③比較醫學  通常認為，機體內動脈血栓產生的決定因素是血管內皮損傷及高切率血流(如狹窄)，在高切率區血栓成分主要以血小板為主，而低切率區則以纖維蛋白和紅細胞為主。而靜脈血栓產生的決定因素則是內皮損傷，血液淤積呈高凝狀態，其血栓主要成分是纖維蛋白、紅細胞、少量的血小板及白細胞。本模型造模機制為當直流電刺激頸動脈壁時可造成血管損傷，使血管內膜變得粗糙不平，引起血小板黏附、聚集，并釋放一系列活性物質，激活機體內源性凝血系統；同時受損血管內膜釋放的組織凝血活素又可激活機體外源性凝血系統，導致動脈管腔內逐漸形成肉眼可見的混合血栓。本模型形成的血栓成分在電刺激區主要以血小板及纖維蛋白為主，并可見少量紅細胞及白細胞；而在電刺激遠端則以纖維蛋白及紅細胞為主。采用本方法復制的大鼠動脈血栓與人類動脈血栓在組織形態結構上相似，適用于作抗血栓形成藥物篩選方面的研究。

(3)光化學誘導大鼠血栓模型

①復制方法  成年實驗大鼠，按30mg/kg體重的劑量經腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將大鼠側臥固定于手術臺上，頭部皮膚常規消毒與去毛。用無菌手術經左側顳部入路，于左眼外眥和左耳外耳道連線上近眼外眥1/3處作一垂直長約2cm的弧形切口，分離顳肌并去除顴弓，用拉鉤拉開下頜關節，在卵圓孔前上方用牙科鉆鉆一直徑為5mm的骨窗，切開硬腦膜即可見大腦中動脈(MCA)，選擇MCA的近端(起始部)和從嗅束至大腦下靜脈間的一段MCA為光照部位，將自制LG-150B冷光源的光纖端口置于距MCA表面約5mm處，將光纖所射出的光束垂直對準MCA。先將光纖移至MCA起始部，經股靜脈注入1.5％虎紅B(四碘四氯熒光素鈉)5min后，注射劑量為2ml/kg體重，再持續光照10min；然后將光纖移到嗅束至大腦下靜脈段MCA表面，再注入半量虎紅B，仍持續照射10min，即可制備成功血栓模型。

②模型特點  模型制作過程中采用分離顳肌、拉開下頜關節的方法，既可保留術后模型大鼠的咀嚼功能，又能提高模型動物的存活率。同時采用分步照射法，并在兩次注射光敏劑時劑量減半，可避免動物損傷程度過重，從而制備出較為實用可靠的大腦中動脈血栓模型。本方法制備的血栓模型穩定，結果可靠，成功率高。

③比較醫學  本模型的造模機制是由于虎紅B在單色綠光下可產生并釋放單態氧，導致血管內皮細胞膜上的不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應，造成細胞膜的通透性發生改變，Ca2+內流增加；同時脂質過氧化物增加又可破壞機體內前列環素(PGI2)與血栓素B2(TXB2)的平衡，促進血管內的血小板聚集與黏附，激活凝血過程，形成血栓并進一步阻塞血管導致缺血；在凝血過程中可產生血管活性物質及神經毒性物質，這些物質可破壞腦細胞尤其是血一腦脊液屏障，致病機制與人類腦梗死發生極為相似。本模型的血栓形成過程與臨床上人類腦血栓形成在發病機制、血栓形成過程、損害程度方面較為相近，造模方法對模型動物血管本身無機械性損害，可應用于臨床上腦血管病的發病機制、藥物篩選及康復醫學的實驗研究。

2.化學藥物誘導法

(1)胰蛋白酶血栓形成法

①復制方法  體重約為2.5kg的新西蘭兔，按30mg/kg體重的劑量經耳緣靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將兔仰臥固定于手術臺上。頸部皮膚常規消毒與去毛。用無菌手術于頸部正中作一切口，鈍性分離暴露右側頸總動脈約2.5cm，用顯微外科動脈夾夾住頸總動脈近心端和遠心端，兩端分別插入8號針頭，在針頭進入部位結扎血管，兩端結扎線相距1.5cm；經近心端針頭用輸液泵勻速(0.6ml/min)灌注1.0％胰蛋白酶15min。然后以相同速度灌注生理鹽水沖洗并經遠心端排出，后拔出針頭用無創傷性針線縫合針孔。手術閉，放開動脈夾使血流復通。

②模型特點  模型制作方法簡便、可靠，重復性好。

③比較醫學  模型造模機制：由于胰蛋白酶具有蛋白水解作用，其進入模型動物機體后可使血管內膜和部分肌層脫落，造成血小板黏附、聚集，終導致血栓形成。本模型所形成的血栓組織形態結構富含血小板和纖維蛋白，與臨床上動脈血栓形成相似，可用于抗血栓藥物療效觀察和篩選方面的研究。

(2)*(H2O2)血栓形成法

①復制方法  體重約為2.5kg的新西蘭兔，按30mg/kg體重的劑量經耳緣靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將兔仰臥固定于手術臺上。頸部皮膚常規消毒與去毛。用無菌手術于頸部正中作一切口，鈍性分離暴露其一側頸總動脈，用兩個顯微外科動脈夾夾閉頸總動脈，夾間距離約為2.5cm，用4號針頭刺入動脈并結扎固定，用針筒迅速抽出動脈夾之間動脈內的殘留血液，并用生理鹽水反復沖洗3～4次，直至動脈段內無殘血。然后用10％*(H2O2)溶液0.4ml分4～5次注入動脈段內連續作用10min，再用生理鹽水沖洗2～3次后，用黏合膠黏合針孔，放開動脈夾恢復血流。

②模型特點  模型制作方法簡單、效果可靠，形成的血栓主要為白色血栓，符合臨床動脈血栓的特征。

③比較醫學  模型造模機制：*進入機體血管后可損傷血管內膜，并引起血小板黏附、聚集，終導致血栓形成。本模型適用于探索預防血栓形成方法方面的研究。

(3)三氯化鐵(FeCl3)血栓形成法

①復制方法  成年實驗大鼠，按30mg/kg體重的劑量經腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將大鼠側臥固定于手術臺上，頭部皮膚常規消毒與去毛。用無菌手術自眼眥和外耳道中線處剪一切口，除去顴弓，暴露顳前窩及鱗狀骨大部分，隨后在顴弓和鱗狀骨前聯合的前下方約2mm處用牙科鉆一直徑約2mm的小顱窗，暴露大腦中動脈(MCA)，用一小片塑料薄膜保護血管周圍組織。將吸有50％三氯化鐵(FeCl3)溶液10μl的小片濾紙敷在暴露的大腦中動脈上20min，共敷兩次后去掉濾紙。再用生理鹽水沖洗局部組織，常規手術逐層縫合。

②模型特點  模型動物形成的動脈血栓為混合血栓，主要成分為血小板、紅細胞及纖維蛋白等。模型制作方法簡單、可靠，重復性好，但由于造模時需去除顴弓，影響動物進食，不利于作觀察。

③比較醫學  本模型利用鐵離子進入機體血管后，可作用于血管壁造成血管內膜損傷，血小板黏附、聚集，終形成血栓的原理建立。模型制作過程中仍保留有大腦中動脈，可進行血管動態觀察，比較接近于臨床患者的實際情況，本模型適用于抗栓藥物和溶栓藥物的篩選及療效觀察，還適用于TTC染色技術直觀地觀察腦梗死程度。

3.血栓誘導法

(1)復制方法  成年雄性KM小鼠或SD大鼠，將角叉菜膠用生理鹽水配制成0.1％和1％溶液后，經小鼠腰背部和大鼠后肢足跖部皮下注射。注射3～14h后，大多數模型動物的尾尖部可出現暗紅色血栓形成區，并逐漸向尾根部擴大；注射48～72h后局部可從發紺變為黑色，隨后尾部干細斷落。

(2)模型特點  注射24h后，模型動物尾部小靜脈和毛細血管內含有纖維素，以及少量白細胞及血小板，血管內皮細胞核濃縮呈骰子狀，血管內壁中性粒細胞靠邊；72h時可見較大血管呈炎癥改變并伴有混合性血栓形成。由于血栓發生在尾部且界限明顯，可從體表直接觀察血栓形成出現的時間與發展過程，并能測量血栓形成波及的范圍或長度，可為研究體內血栓形成全過程提供一個簡便、直觀的動物模型。模型制作方法簡單，結果可靠，重復性好。

(3)比較醫學  模型制作使用的角叉菜膠是從海藻中提取的含硫酸多糖物質，也是一種較強的致炎物質，其誘發的動物尾動脈局部血栓與血管內炎癥密切相關。由于炎癥時可釋放炎癥介質如白細胞介素-1、腫瘤壞死因子等，它們可破壞正常血管內皮細胞維持凝血與纖溶之間的平衡作用，從而促發動物血栓形成。同時血管內皮細胞損傷時可造成某些舒血管物質如乙酰膽堿等分泌減少，縮血管物質如內皮素等增多，引起局部血管痙攣，從而加重局部血管的缺血缺氧狀況，進一步促進血栓形成及血管內皮損傷。本模型適用于臨床上抗血栓藥物療效觀察和篩選方面的研究。

4.手術法

(1)犬股動脈異物法血栓模型

①復制方法  體重約為10kg的雄性實驗犬，按30mg/kg體重的劑量經靜脈注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將犬仰臥固定于手術臺上。用無菌手術分離其一側股動脈約7cm，在其兩端用顯微外科動脈夾夾閉，夾間距離約為3.5cm，沿股動脈遠心端向近心端方向在夾閉段股動脈內安插直徑為0.5cm、長度為1.5cm的單股螺旋鋼絲，進入血管內腔后結扎固定，行血管縫合術，再用醫用生物黏合膠黏合。放開動脈夾，恢復血流暢通，確定手術視野無滲血后，常規手術逐層縫合。

②模型特點  制作方法簡單易行，可靠性強，重復性好。

③比較醫學  在模型動物股動脈內放置螺旋鋼絲線圈，可造成動脈內膜損傷，造成局部血流動力學改變，進一步激活機體凝血系統，促進血小板凝集并釋放一系列活性物質，終導致血栓形成。本模型形成的血栓主要由血小板、白細胞及纖維蛋白構成，目前多用于血栓放射免疫顯像方面的研究。

(2)大鼠結扎法

①復制方法  成年實驗大鼠，按30mg/kg體重的劑量經腹腔注射戊丨巴丨比丨妥丨鈉麻醉，麻醉后將大鼠側臥固定于手術臺上，腹部皮膚常規消毒與去毛。無菌手術開腹，分離其下腔靜脈，于左腎靜脈下方用粗絲線結扎下腔靜脈，然后縫合腹壁；結扎2～6h后重新打開腹腔，在結扎線下方2cm處用血管夾夾閉血管，剖開管腔并取出血栓，于60℃烘干后稱量血栓質量，以血栓質量或血栓形成百分率作為評價指標。

②模型特點  采用本方法通常在結扎后2h，模型動物血栓形成率可達到60％～80％，此時處死動物主要觀察血栓形成百分率；結扎6h后模型動物血栓形成率為100％，此時主要觀察血栓質量。模型制作方法簡單易行，重復性好，效果可靠，成功率高。

③比較醫學  用粗絲線結扎大鼠下腔靜脈，可引起局部血流淤滯、缺氧，造成血管內皮細胞損傷，從而啟動內源性凝血系統；同時，血管內黏聚的血小板與局部形成的凝血因子因血流受阻滯留在局部，終導致血栓形成。本模型多用于溶栓藥物體內抗血栓作用的評價。

目前，隨著臨床上血栓性疾病的發病率逐年增高，如何開展有效的診斷、預防和治療，已引起國內外臨床醫學界的廣泛關注。建立各種血栓性疾病動物模型用于實驗研究已成為重要手段，迄今為止已形成了許多動物血栓模型的建立方法。由于各種血栓模型均有各自的特點，因此應根據研究目的和需要來選擇合理的血栓動物模型制作方法，如機械損傷法、股動脈異物法、電流損傷法、胰蛋白酶血栓形成法、*法、角叉菜膠血栓形成法等適用于作動脈血栓的研究；機械損傷法、結扎法則適用于作靜脈血栓的研究；而腦栓塞的研究則可選擇三氯化鐵血栓形成法和光化學法，以免事倍功半。