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軟瓊脂實驗

產品簡介

軟瓊脂實驗是細胞實驗中不常見實驗之一,通常由從事細胞實驗多年的實驗人員進行操作,通過的實驗操作,以實驗結果的性。

產品型號:
更新時間:2026-03-20
廠商性質:代理商
訪問量:1528
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步:配制瓊脂
  1. 配制底層瓊脂


    • 用基礎培養基(如DMEM)配制1%-1.2%的高熔點瓊脂糖溶液,加熱煮沸使其全融化,隨后置于42-45°C水浴中恒溫冷卻,防止凝固。


    • 將等體積的2×全培養基(含2×濃度的血清和雙抗)預熱至相同溫度。


    • 將兩者等體積混合,得到終濃度為0.5%-0.6%的底層瓊脂工作液


  2. 配制上層瓊脂


    • 方法同上,但使用濃度更低的瓊脂糖(通常0.3%-0.4%)。


第二步:輔制底層膠
  • 將溫熱的底層瓊脂工作液迅速加入6孔板中(每孔約1-1.5 mL),輕輕搖晃確保鋪平。


  • 室溫靜置10-15分鐘,使其全凝固。凝固后的底層膠為細胞提供支撐,并防止其貼壁。


第三步:制備細胞懸液與輔制上層膠
  1. 制備細胞懸液:用全培養基重懸待測細胞,計數。細胞濃度是關鍵,通常每孔接種1000-10000個細胞,具體取決于細胞成克隆能力。


  2. 混合:將預熱的上層瓊脂工作液與含有細胞的培養基等體積混合,確保細胞均勻分布,形成終濃度為0.15%-0.2%的含細胞上層瓊脂混合液


  3. 輔上層膠:立即將1-1.5 mL混合液輕柔地加在已凝固的底層膠上,注意不要破壞底層膠。輕輕晃動鋪平。


  4. 凝固:室溫下靜置10-15分鐘,使其全凝固。


第四步:培養與觀察
  1. 添加培養基:待上層膠凝固后,沿孔壁緩慢加入1-2 mL預熱的新鮮全培養基,覆蓋膠的表面,以防止瓊脂干燥,并為細胞提供營養。注意不要沖散上層膠


  2. 培養:將培養板置于37°C, 5% CO? 培養箱中培養。


  3. 換液每隔2-3天,小心吸去舊培養基,沿孔壁緩慢加入新鮮培養基。此步驟需格外小心,避免破壞軟膠


  4. 觀察:培養1-3周后,在倒置顯微鏡下觀察克隆形成情況。惡性程度高、增殖快的細胞通常1-2周即可見明顯克隆。


第五步:染色、計數與分析
  1. 染色:通常使用結晶紫、MTT或INT等染料進行活細胞染色,使克隆更易觀察和計數。


    • 結晶紫法:吸去培養基,加入固定液(如甲醇)固定,再加入結晶紫染色液染色,用PBS或水清洗。


  2. 計數與分析


    • 手動計數:在顯微鏡下,計數直徑大于50-100 μm(或細胞數>50個)的克隆。通常使用低倍鏡(4×或10×物鏡)掃描整個孔。


    • 軟件分析:可使用ImageJ等圖像分析軟件,對整孔圖像進行自動克隆識別和計數。


    • 報告結果:通常以克隆形成率表示:(克隆數 / 接種細胞數) × 100%。或直接比較不同處理組之間的克隆數量和大小





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