《Advanced science》是Wiley出版集團旗下的一本開放獲取（Open Access）綜合性學(xué)術(shù)期刊，于2014年創(chuàng)刊。在中科院最新升級版分區(qū)表中，大類學(xué)科為材料科學(xué)1區(qū)，小類學(xué)科中化學(xué)綜合為1區(qū)、納米科技為2區(qū)、材料科學(xué)綜合為1區(qū)，屬于TOP期刊。《Advanced science》是一本跨學(xué)科開放獲取期刊，涵蓋材料科學(xué)、物理和化學(xué)、醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)以及工程學(xué)等領(lǐng)域，主要發(fā)表這些領(lǐng)域的應(yīng)用研究成果。

出版周期：12 issues/year；

影響因子：14.1；

ISSN：2198-3844；

發(fā)文量：3290篇/年；

審稿速度：平均12周；

版面費：USD 5270.00；

一、研究背景與目標(biāo)

肺纖維化（PF）是多種肺部疾病的進展性致命結(jié)局，特發(fā)性肺纖維化（IPF）為主要亞型，由慢性肺部炎癥驅(qū)動，患者確診后平均生存期僅3-5年。全球發(fā)病率上升，新冠疫情后PF發(fā)生率達2-6%，約44.9%的新冠幸存者發(fā)展為PF。臨床僅吡非尼酮和尼達尼布獲批，療效有限，亟需闡明發(fā)病機制以開發(fā)新療法。成纖維細胞膠原合成是PF的核心特征，但其異常激活的觸發(fā)因素不明。本研究聚焦組織蛋白酶K（CTSK）在PF中的作用及機制。

二、關(guān)鍵技術(shù)總結(jié)

本文為探究組織蛋白酶 K（CTSK）在肺纖維化（PF）中的作用及機制，采用了多種實驗技術(shù)，涵蓋分子生物學(xué)、細胞生物學(xué)、動物模型及臨床樣本分析等領(lǐng)域，具體如下：

1. 肺纖維化模型：通過氣管內(nèi)注射博來霉素（BLM）構(gòu)建小鼠PF模型，用于評估CTSK對纖維化進展的影響；通過百草ku（PQ）誘導(dǎo)急性肺損傷（ALI）模型，結(jié)合不同時間點采樣進行蛋白質(zhì)組學(xué)分析。

2. 基因編輯模型：構(gòu)建成纖維細胞特異性CTSK條件敲除小鼠（Col1a2-CreERT；CTSK flox/flox），驗證內(nèi)源性CTSK的作用。

3. 藥物干預(yù)：對模型小鼠施用重組CTSK（rCTSK）、CTSK抑制劑（odanacatib）、內(nèi)吞抑制劑（Pitstop2）、SMAD3抑制劑（SIS3）及谷氨酰胺酶抑制劑（DON等），探究相關(guān)通路的作用。

4. 蛋白質(zhì)組學(xué)與單細胞測序（scRNA-seq）：通過蛋白質(zhì)組學(xué)篩選PF模型小鼠肺組織中差異表達的組織蛋白酶家族成員，結(jié)合scRNA-seq（數(shù)據(jù)集 GSE111664、GSE136831 等）定位CTSK在成纖維細胞中的富集。

5. 細胞模型：使用人成纖維細胞系（MRC-5），經(jīng)TGF-β1誘導(dǎo)模擬成纖維細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化（FMT），研究CTSK對膠原合成的影響；分離原代小鼠肺成纖維細胞進行驗證。

6. 蛋白相互作用驗證：采用免疫共沉淀（Co-IP）驗證CTSK與SNX9的直接相互作用；通過AlphaFold3預(yù)測結(jié)合位點，結(jié)合丙氨酸突變實驗確定關(guān)鍵氨基酸殘基。

7. 分子表達檢測：利用Western blot檢測蛋白質(zhì)表達水平，實時定量PCR（qRT-PCR）分析 mRNA 水平，免疫熒光染色觀察蛋白定位與共定位。

8. 非靶向與靶向代謝組學(xué)：通過LC-MS/MS對TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細胞（經(jīng)rCTSK處理）進行非靶向代謝組學(xué)分析，結(jié)合KEGG和MSEA富集分析篩選差異代謝通路（如谷氨酰胺代謝）；通過靶向代謝組學(xué)檢測谷氨酰胺、谷氨酸及脯氨酸等代謝物水平。

9. 組織與病理分析：采用Masson三色染色和Sirius Red染色檢測肺組織膠原沉積；免疫組化分析CTSK、SNX9等蛋白在肺組織中的表達與定位；原子力顯微鏡檢測肺組織硬度，評估纖維化程度。

10.  臨床樣本分析：收集PF患者及健康對照的肺組織、支氣管肺泡灌洗液（BALF）和血清樣本，通過ELISA測定血清和BALF中CTSK及谷氨酰胺水平；結(jié)合生存分析（Kaplan-Meier）評估CTSK與患者預(yù)后的相關(guān)性。

11. 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析：利用公開RNA-seq數(shù)據(jù)集（GSE124685、GSE70866）分析CTSK家族成員在PF患者中的表達差異及與生存的關(guān)聯(lián)。

三、主要研究結(jié)果

1、CTSK在PF進展過程中的積累

通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析PQ誘導(dǎo)ALI小鼠模型的肺組織發(fā)現(xiàn)，包括CTSK在內(nèi)的組織蛋白酶家族成員（如CTSA、CTSB等）在ALI進展過程中（第1、3、7天）逐漸上調(diào)，其中CTSK 的積累最為顯著。而在博來霉素（BLM）誘導(dǎo)的PF小鼠肺組織中，CTSK的mRNA水平較對照組顯著升高，且通過免疫組化和Western blot在蛋白水平得到驗證。同時，CTSK的表達在BLM誘導(dǎo)后逐漸增加，于第21天達到峰值，與模型中嚴(yán)重PF的發(fā)生時間一致。另外，基于BLM誘導(dǎo)PF小鼠的單細胞測序數(shù)據(jù)（GSE111664），CTSK在巨噬細胞和成纖維細胞中特異性上調(diào)，且成纖維細胞數(shù)量顯著增加。此外， PF患者的單細胞測序數(shù)據(jù)（GSE136831）顯示，成纖維細胞中CTSK也呈高表達；在經(jīng)TGF-β1處理以模擬成纖維細胞-肌成纖維細胞轉(zhuǎn)化（FMT）的人成纖維細胞系（MRC-5）中，CTSK在mRNA和蛋白水平均顯著上調(diào)。

圖1、CTSK在嚴(yán)重肺損傷及PF進展過程中在成纖維細胞中富集

2、CTSK對成纖維細胞膠原蛋白合成及肺纖維化PF進程的影響

對PF小鼠的單細胞測序數(shù)據(jù)（GSE132771）分析顯示，CTSK陽性成纖維細胞中膠原蛋白相關(guān)基因（如 Col1a1、Col1a2、Col3a1）的表達顯著高于CTSK陰性成纖維細胞，提示CTSK可能促進膠原蛋白合成。同時，在TGF-β1誘導(dǎo)的人成纖維細胞系（MRC-5）中，高濃度（0.1 μg/mL）的重組CTSK（rCTSK）經(jīng)24小時處理后，可特異性上調(diào)COL1A1的表達，而對 COL1A2、COL3A1及α-SMA的表達無顯著影響，且該結(jié)果在原代小鼠肺成纖維細胞中得到驗證。另外，通過蛋白酶體抑制劑（MG132）和蛋白質(zhì)合成抑制劑（環(huán)己酰亞胺）實驗發(fā)現(xiàn)，rCTSK通過促進COL1A1的合成（而非抑制其降解）來增加其蛋白水平，且對α-SMA的表達無影響。在BLM誘導(dǎo)的PF小鼠模型中，施用rCTSK后，肺組織中COL1A1的表達和羥脯氨酸含量顯著增加，Masson三色染色和Sirius Red染色顯示膠原沉積和膠原纖維增多，原子力顯微鏡（AFM）證實肺組織硬度增加；同時，纖維化標(biāo)志物mRNA水平也顯著升高。rCTSK對纖維化進程的時序影響研究結(jié)果顯示，BLM誘導(dǎo)后，在第7天施用rCTSK可顯著上調(diào)第14天和第21天肺組織中CTSK和Col1a1的蛋白表達，且這些時間點的血清 CTSK水平也明顯升高，表明過量CTSK在肺損傷后會加劇PF進展。綜上，圖2的結(jié)果證實CTSK可通過促進成纖維細胞中膠原蛋白（尤其是COL1A1）的合成，加劇肺纖維化的嚴(yán)重程度。

圖2、CTSK可通過促進成纖維細胞中膠原蛋白的合成加劇肺纖維化的嚴(yán)重程度

3、CTSK與SNX9的相互作用及其對成纖維細胞膠原蛋白合成的調(diào)控機制

圖3、CTSK與SNX9結(jié)合促進成纖維細胞中膠原蛋白合成進而加劇肺纖維化進程

通過免疫共沉淀（Co-IP）實驗驗證，在經(jīng)TGF-β1和重組CTSK（rCTSK）處理的人成纖維細胞系（MRC-5）中，CTSK與SNX9存在直接相互作用，且隨著處理時間延長，COL1A1 和SNX9的積累增加。AlphaFold3預(yù)測結(jié)合界面顯示，CTSK的LYS220/CYS221殘基與 SNX9的TRP39殘基是相互作用的關(guān)鍵位點，丙氨酸突變實驗進一步證實了這些位點的重要性；免疫熒光顯示CTSK與SNX9主要在細胞質(zhì)和核膜共定位，提示CTSK可能通過與 SNX9結(jié)合被內(nèi)吞。在MRC-5細胞中敲低SNX9后，TGF-β1誘導(dǎo)的COL1A1表達降低，且 rCTSK無法再上調(diào)COL1A1的產(chǎn)生，表明SNX9是CTSK促進膠原蛋白合成的關(guān)鍵介質(zhì)。另外，使用網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞作用（CME）抑制劑Pitstop2處理MRC-5細胞后，CTSK的細胞內(nèi)積累減少，同時COL1A1的表達也顯著降低，證實內(nèi)吞過程在CTSK調(diào)控膠原蛋白合成中不可少的。此外，體內(nèi)驗證實驗表面，在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，聯(lián)合施用rCTSK和Pitstop2后，與單獨施用rCTSK的小鼠相比，肺組織中羥脯氨酸含量、COL1A1 和CTSK蛋白水平顯著降低，Masson和Sirius Red染色顯示膠原沉積減少，纖維化標(biāo)志物的mRNA水平也下降，表明阻斷SNX9介導(dǎo)的內(nèi)吞可緩解CTSK加劇的肺纖維化。該部分結(jié)果揭示CTSK通過與SNX9結(jié)合并經(jīng)內(nèi)吞作用，促進成纖維細胞中膠原蛋白合成，進而加劇肺纖維化進程。

4、CTSK通過TGF-β1-SMAD3信號通路促進膠原蛋白合成的機制研究

在經(jīng)TGF-β1和重組CTSK（rCTSK）處理的人成纖維細胞系（MRC-5）中，SMAD3的磷酸化水平隨處理時間延長顯著升高，且與COL1A1的表達增加同步；在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，施用rCTSK后，肺組織中磷酸化SMAD3（p-SMAD3）、COL1A1、SNX9和 CTSK的蛋白水平均上調(diào)。而在MRC-5細胞中敲低SNX9后，rCTSK增強的胞質(zhì)p-SMAD3水平顯著降低，且核內(nèi)p-SMAD3的積累也大幅減少；免疫熒光實驗進一步證實，SNX9敲低后，p-SMAD3與SNX9的共定位減少，表明SNX9是CTSK激活SMAD3的關(guān)鍵介質(zhì)。免疫共沉淀（Co-IP）實驗顯示，CTSK、SNX9與p-SMAD3之間存在關(guān)聯(lián)，提示三者可能形成復(fù)合物共同參與信號傳遞。此外，使用SMAD3抑制劑SIS3處理MRC-5細胞后，無論是基礎(chǔ)狀態(tài)還是rCTSK誘導(dǎo)的COL1A1表達均被顯著抑制，同時細胞內(nèi)CTSK水平也降低，證實SMAD3激活是CTSK促進膠原蛋白合成的必要環(huán)節(jié)。圖4的結(jié)果揭示CTSK通過 SNX9介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，激活TGF-β1誘導(dǎo)的SMAD3磷酸化，進而促進成纖維細胞中膠原蛋白的合成。

圖4、CTSK通過SNX9介導(dǎo)的內(nèi)吞作用，激活TGF-β1誘導(dǎo)的SMAD3磷酸化，進而促進成纖維細胞中膠原蛋白的合成

5、CTSK對谷氨酰胺代謝的調(diào)控及其在膠原蛋白合成中的作用

對PF患者的單細胞測序數(shù)據(jù)（GSE136831）分析顯示，CTSK陽性成纖維細胞中谷氨酸顯著富集，提示CTSK可能與谷氨酰胺代謝相關(guān)。同時，對經(jīng)TGF-β1和重組CTSK（rCTSK）處理的MRC-5細胞進行非靶向代謝組學(xué)分析，KEGG和MSEA富集分析表明，rCTSK顯著激活包括谷氨酰胺代謝在內(nèi)的氨基酸相關(guān)通路，其中谷氨酰胺代謝通路因參與膠原蛋白合成所需的脯氨酸和甘氨酸生成而成為關(guān)鍵通路。靶向代謝組學(xué)檢測顯示，rCTSK處理后，TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細胞中谷氨酰胺、谷氨酸和脯氨酸水平顯著升高，其中谷氨酰胺和脯氨酸的增加更為明顯。谷氨酰胺酶1（GLS1）是谷氨酰胺代謝的關(guān)鍵酶，rCTSK可上調(diào)TGF-β1誘導(dǎo)的MRC-5細胞中GLS1的mRNA和蛋白表達及酶活性；而敲低SNX9后，rCTSK對GLS1的上調(diào)作用被顯著抑制，谷氨酰胺水平也隨之降低，表明CTSK通過SNX9促進GLS1介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝。綜上，圖5的結(jié)果揭示CTSK通過SNX9增強GLS1的表達和活性，激活谷氨酰胺代謝通路，為膠原蛋白合成提供原料，進而促進肺纖維化進程。

圖5、CTSK高表達促進谷氨酰胺代謝

6、CTSK通過谷氨酰胺代謝促進成纖維細胞膠原蛋白合成的機制研究

在不含谷氨酰胺的培養(yǎng)基中，經(jīng)TGF-β1和重組CTSK（rCTSK）處理的人成纖維細胞系（MRC-5）中，COL1A1的表達顯著降低，而α-SMA水平不受影響；反之，在培養(yǎng)基中額外添加谷氨酰胺可顯著增加COL1A1的產(chǎn)生，表明谷氨酰胺是CTSK促進膠原蛋白合成的關(guān)鍵原料。

圖6、CTSK觸發(fā)的谷氨酰胺代謝促進成纖維細胞膠原合成

另外，使用谷氨酰胺酶（GLS1）抑制劑（CB839、BPTES、DON）處理MRC-5細胞后，rCTSK 誘導(dǎo)的COL1A1表達被顯著抑制，但α-SMA水平未受影響，證實GLS1介導(dǎo)的谷氨酰胺代謝在CTSK促進膠原蛋白合成中起核心作用。而在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠模型中，聯(lián)合施用rCTSK和DON（GLS1 抑制劑）后，與單獨施用rCTSK的小鼠相比，肺組織中COL1A1的表達、羥脯氨酸含量顯著降低，Masson三色染色和Sirius Red染色顯示膠原沉積減少，纖維化標(biāo)志物的mRNA水平也下降，表明抑制谷氨酰胺代謝可緩解CTSK加劇的肺纖維化。該部分的結(jié)果證實CTSK通過激活谷氨酰胺代謝通路促進成纖維細胞膠原蛋白合成，而抑制該代謝通路可有效減輕肺纖維化程度。

7、CTSK表達與谷氨酰胺水平及PF患者的預(yù)后相關(guān)性分析

對PF患者的RNA-seq數(shù)據(jù)（GSE124685）分析顯示，包括CTSK在內(nèi)的組織蛋白酶家族成員在肺組織中顯著上調(diào)，其中CTSK的表達水平最高。免疫組化和Western blot驗證顯示，PF患者肺組織中CTSK、SNX9、GLS1及磷酸化SMAD3（p-SMAD3）的表達均顯著高于健康對照；多重免疫熒光進一步證實這些分子在纖維化肺組織中存在共定位，提示它們在PF 發(fā)病中可能協(xié)同作用。此外，基于PF患者的RNA-seq數(shù)據(jù)（GSE70866）的生存分析顯示，CTSK高表達患者的生存率顯著低于低表達患者，表明CTSK可作為PF預(yù)后的潛在標(biāo)志物。另外，PF患者的支氣管肺泡灌洗液（BALF）和血清中CTSK水平顯著高于健康對照及非 PF的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者；且BALF和血清中CTSK水平高的患者死亡率顯著升高。同時，PF患者血清中谷氨酰胺水平顯著升高，且與CTSK水平呈正相關(guān)，進一步支持CTSK通過調(diào)控谷氨酰胺代謝影響PF進展的機制在臨床中的相關(guān)性。結(jié)果表明，CTSK及其相關(guān)分子在PF患者中異常上調(diào)，血清CTSK水平可作為 PF 預(yù)后評估的潛在標(biāo)志物，且其與谷氨酰胺水平的相關(guān)性為臨床干預(yù)提供了方向。

圖7、患有肺纖維化（PF）的急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）患者中，外周組織蛋白酶 K（CTSK）含量與谷氨酰胺水平相關(guān)，且提示預(yù)后不良

四、全文結(jié)論

研究表明，組織蛋白酶 K（CTSK）在肺纖維化（PF）中通過雙重機制發(fā)揮作用：早期降解細胞外基質(zhì)，后期過量積累則與分選連接蛋白 9（SNX9）結(jié)合被內(nèi)吞，激活TGF-β1-SMAD3 通路，上調(diào)谷氨酰胺酶 1（GLS1），促進谷氨酰胺代謝和膠原蛋白合成，加劇PF。臨床數(shù)據(jù)顯示，PF患者血清CTSK水平與谷氨酰胺水平正相關(guān)，且高CTSK預(yù)示不良預(yù)后。綜上，CTSK和谷氨酰胺可作為PF預(yù)后標(biāo)志物及治療靶點。

圖8、流程圖

參考文獻：

Chen M, Meng X, Zhu Y, Wang D, Wang M, Wang Z, Tian X, Zhang J, Yue Z, Yang Z, Wang R. Cathepsin K Aggravates Pulmonary Fibrosis Through Promoting Fibroblast Glutamine Metabolism and Collagen Synthesis. Adv Sci (Weinh). 2025 Jul 3:e13017. doi: 10.1002/advs.202413017. Epub ahead of print. PMID: 40605618.