自身免疫性?xún)?nèi)耳病動(dòng)物模型

(1)復(fù)制方法  取4周齡近交系雄性C57BL/6小鼠，以及體重為300～400g，經(jīng)檢查耳郭反射正常，無(wú)中耳感染的豚鼠。豚鼠麻醉后心臟灌注，斷頭取顳骨，在4℃無(wú)菌含1mg/L抑肽酶的10mmol/L Tris緩沖液中剝離全部?jī)?nèi)耳膜性組織，勻漿。勻漿液離心，取上清液-20℃凍存；沉淀在含0.5％十二烷基硫酸鈉、0.5％β-巰基乙醇、1％甘油、2mmol/ L苯甲丨基丨磺丨酰丨氟、10mmol/L N-己基順丁烯二甲亞胺的50mmol/L Tris緩沖液中勻漿，計(jì)算蛋白含量，-80℃分裝凍存。用制備的內(nèi)耳抗原(Inner Ear Antigen, IEAg)免疫小鼠，每只模型小鼠頸背部皮下多點(diǎn)注射IEAg弗氏佐劑(Complete Freund Adjuvant, CFA)乳劑，足背皮內(nèi)注射百日咳減毒活菌50μl(含25×1000000000個(gè)菌體)，IEAg含量為100μg。免疫后作小鼠雙側(cè)耳聽(tīng)性腦干反應(yīng)(auditory brainstem response, ABR)測(cè)試：動(dòng)物麻醉后置聲、電屏蔽室內(nèi)，采用誘發(fā)電位儀測(cè)試。取刺激聲0.1ms為短聲，間隔時(shí)間為50ms，濾波100～3000Hz，掃描時(shí)間為10ms，疊加500次。低于刺激聲30dB的白噪聲對(duì)側(cè)耳作掩蔽。以波Ⅱ的反應(yīng)閾為標(biāo)準(zhǔn)判斷ABR的反應(yīng)閾。分別在造模后7、14、21、28d檢測(cè)動(dòng)物血清中抗IEAg抗體，并取顳骨組織，制作內(nèi)耳組織常規(guī)切片，HE染色后，光鏡下觀察。

(2)模型特點(diǎn)  經(jīng)IEAg免疫后2周內(nèi)模型動(dòng)物體重呈進(jìn)行性下降，免疫3周后體重可恢復(fù)至免疫前水平，并緩慢增加；動(dòng)物尚可出現(xiàn)活動(dòng)減少、耳廓反射不敏感、走路不穩(wěn)等臨床表現(xiàn)。造模前C57BL/6小鼠ABR反應(yīng)閾均值為46dB SPL，左、右耳無(wú)顯著性差異；造模后第7日動(dòng)物ABR反應(yīng)閾即顯著提高。模型動(dòng)物鏡下病理組織學(xué)觀察顯示，內(nèi)耳組織中鼓階、蝸管、前庭階及蝸軸血管周?chē)休^多炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，造模后前2周可見(jiàn)較多內(nèi)淋巴積水；并可見(jiàn)螺旋神經(jīng)節(jié)細(xì)胞腫脹及壞死樣改變，細(xì)胞數(shù)量在免疫后進(jìn)行性減少。本模型應(yīng)用豚鼠IEAg造模后，且模型動(dòng)物聽(tīng)力改變與細(xì)胞浸潤(rùn)程度及血清抗IEAg抗體水平呈顯著性正相關(guān)，提示免疫和體液反應(yīng)在誘發(fā)自身免疫性?xún)?nèi)耳病(autoimmune inner ear disease, AIED)時(shí)可能起重要作用。

(3)比較醫(yī)學(xué)  自身免疫性?xún)?nèi)耳病在臨床上目前仍然發(fā)病機(jī)制不明，也無(wú)特異性實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)，且治療原則存在爭(zhēng)議、治療效果不理想。建立與臨床AIED相似的疾病動(dòng)物模型，有助于闡明自身免疫性?xún)?nèi)耳病的發(fā)病機(jī)制及分析內(nèi)耳的免疫調(diào)節(jié)治療效果。以往的研究報(bào)道大多數(shù)實(shí)驗(yàn)性 AIED均以遠(yuǎn)交系豚鼠作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，采用初次系統(tǒng)免疫后多次加強(qiáng)免疫的方式，通過(guò)機(jī)體產(chǎn)生的自身抗體經(jīng)體液免疫介導(dǎo)免疫反應(yīng)而誘發(fā)。這些模型成功率較低(20％～50％)；聽(tīng)力損害程度較輕(8～25dB)；內(nèi)耳病理改變不典型；多次加強(qiáng)免疫的實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)，增加了實(shí)驗(yàn)中不確定因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。由于遠(yuǎn)交系動(dòng)物在可重復(fù)性及免疫學(xué)分析的細(xì)節(jié)研究方面均較近交系動(dòng)物差，所以這些模型并不能準(zhǔn)確反映人類(lèi)AIED的發(fā)病機(jī)制以及病理生理改變。本模型采用內(nèi)耳抗原免疫動(dòng)物后出現(xiàn)顯著的聽(tīng)力下降，聽(tīng)力損害程度隨免疫進(jìn)程而不斷加劇，血清中可檢測(cè)到抗內(nèi)耳組織的自身抗體，這些變化與臨床上AIED患者的表現(xiàn)一致；形態(tài)學(xué)上表現(xiàn)的血管周?chē)椎忍卣餍宰陨砻庖咝該p害可進(jìn)一步證實(shí)。 C57BL/6小鼠作為一種廣泛使用的近交系小鼠，其個(gè)體間極為一致，且對(duì)實(shí)驗(yàn)反應(yīng)也一致，可以消除雜合遺傳背景對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響。C57BL/6小鼠隨年齡增加可表現(xiàn)出與高頻相關(guān)的老年性聽(tīng)力下降，因此這種動(dòng)物模型被用于研究老年性耳聾。采用本方法誘導(dǎo)的AIED模型，具有發(fā)病率高，聽(tīng)力損害程度嚴(yán)重，內(nèi)耳病理改變典型，造模周期短，制作方法簡(jiǎn)便，實(shí)驗(yàn)條件比較簡(jiǎn)單，其他因素容易控制的優(yōu)點(diǎn)。